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    本發明提供一種預測接受上皮生長因子受體酪胺酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)治療之EGFR突變肺腺癌病患對治療的反應的方法，以及一種預測接受EGFR-TKI治療之EGFR突變肺腺癌病患預後的方法。本發明之方法確定了特定染色體上(尤其是染色體5p、7p、8q或14q)的集群基因組改變可作為一種預測治療反應或預後的工具。
    公开号:TW201311906A
    申请号:TW101123966
    申请日:2012-07-04
    公开日:2013-03-16
    发明作者:Sung-Liang Yu；Shin-Sheng Yuan；Gee-Chen Chang；Hsuan-Yu Chen；Ker-Chau Li；Pan-Chyr Yang
    申请人:Univ Nat Taiwan；Academia Sinica；Taichung Veterans General Hospital；
    IPC主号:C12Q1-00
    专利说明:
    預測EGFR突變肺腺癌病患對藥物治療的反應與預後之方法
    本發明提供一種預測接受上皮生長因子受體酪胺酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)治療之EGFR突變肺腺癌病患對治療的反應的方法，以及一種預測接受EGFR-TKI治療之EGFR突變肺腺癌病患預後的方法。具體而言，該方法確定了特定染色體上的集群基因組改變可作為一種預測治療反應或預後的工具。
    肺腺癌是肺癌的主要類型，是全世界癌症死亡最常見的原因。在肺癌的所有組織學類型中，腺癌是最普遍的並具有最大的異質性。
    肺腺癌(為非小細胞肺癌(NSCLC)的一種)的治療一直是相對較貧乏的。即使是治療晚期癌症的主要療法-化療也只是勉強有效(除了對原位癌以外)。雖然手術是最有可能治療肺腺癌的治療選擇，但並不是所有癌症階段皆可行。最近開發抗癌藥物來治療肺腺癌病患的方法著重於減少或消除癌細胞生長和分裂的能力。這些抗癌藥物是用來破壞告訴細胞生長或死亡的信號。正常情況下，細胞生長受到細胞所接收信號的嚴格控制。然而在癌症中的這些信號出了錯，細胞持續生長並以一種無法控制的方式分裂，從而形成腫瘤。當一名叫上皮生長因子(EGF)的蛋白質結合到在許多細胞表面上都有發現的受體時，便開始這些信號傳遞路徑的其中之一。
    EGFR是生長因子受體1型酪胺酸激酶家族之一員，其在細胞生長、分化及存活上扮演著關鍵的角色。這些受體的活化一般是透過與特定配體結合，在受體家族成員間造成異質或同質二聚體，伴隨接下來的酪胺酸激酶區域自磷酸化。在NSCLC病患的亞群中存在有EGFR的突變。EGFR的突變率在東亞患者中(19-26%)高於具有歐洲或美國血統的患者(8-17%)。EGFR突變介導的磷酸化可以活化下游透過Akt路徑的抗凋亡信號傳遞或是透過MAPK/ERK路徑的增殖信號。引人注目的是，具有這些的基因變異的NSCLC病患對EGFR-酪胺酸激酶抑制劑(TKIs)有顯著的反應，且療效也在臨床試驗中被證實(Maemondo M,et al：Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR.N Engl J Med 362：2380-8,2010；Lynch TJ,et al：Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib.N Engl J Med 350：2129-39,2004；Paez JG,et al：EGFR mutations in lung cancer：correlation with clinical response to gefitinib therapy.Science 304：1497-500,2004；Mitsudomi T,et al：Gefitinib versus cisplatin plus docetaxel in patients with non-small-cell lung cancer harbouring mutations of the epidermal growth factor receptor(WJTOG3405)：an open label,randomised phase 3 trial.Lancet Oncol 11：121-8,2010；Mok TS,et al：Gefitinib or Carboplatin-Paclitaxel in Pulmonary Adenocarcinoma.N Engl J Med 361：947-957,2009)。高反應率可能是由於EGFR在催化區域關鍵殘基上的突變，造成與藥物結合時的物理結構改變(Yun CH,et al：Structures of lung cancer-derived EGFR mutants and inhibitor complexes：mechanism of activation and insights into differential inhibitor sensitivity.Cancer Cell 11：217-27,2007)。美國專利第7,932,026號教示EGFR的突變和偵測該突變以及預後的方法，用於鑑定易由抗癌療法如化療及/或激酶抑制劑處理治療的腫瘤。
    雖然好幾個研究已經證實EGFR-TKIs大體上對EGFR突變病患比對EGFR野生型病患更為有效，但是在EGFR突變病患中，治療反應卻相當不一致(Mok TS,et al：Gefitinib or Carboplatin-Paclitaxel in Pulmonary Adenocarcinoma.N Engl J Med 361：947-957,2009)。IPASS研究指出僅有71%的EGFR突變病患對EGFR-TKIs反應良好(Mok TS,et al：Gefitinib or Carboplatin-Paclitaxel in Pulmonary Adenocarcinoma.N Engl J Med 361：947-957,2009)。為了辨別無反應的病患，US 7,858,389提供了使用質譜數據分析的方法，以分類演算法來測定非小細胞肺癌(NSCLC)病患是否可能可以受益於靶向至上皮生長因子受體路徑的單株抗體藥物。US 7,906,342提供了使用質譜數據分析的方法，以分類演算法來測定非小細胞肺癌病患、頭和頸部鱗狀細胞癌或大腸直腸癌病患是否已發展成對靶向至上皮生長因子受體路徑的藥物處理不反應。然而，這些前案使用血液樣本之質譜作為鑑定工具，且效果並不令人滿意。
    由於對治療反應不一致的分子基礎仍舊不為人所知，且沒有可預測治療反應的生物標記，因此仍然需要有一個技術來預測肺腺癌患者對接受EGFR處理的反應。
    本發明辨識在EGFR突變型與EGFR野生型腫瘤間具有不同拷貝數變異(CNAs)的染色體區域，發現在染色體5p、7p、8q或14q上有高度集群的畸變位置。染色體基因群預測了EGFR突變型病患的整體存活率與無疾病進展存活率(progression-free survivals)，但無法預測野生型的。重要的是，在這個基因群中帶有CNA變異之基因的存在與EGFR突變型病患對EGFR-TKIs有較差的反應有關。
    除非另有定義，本發明中使用之科學與技術性術語具有熟習此技藝者所普遍瞭解之意義。此外，除非本文另外明確指示，否則「一」、「一個」及「該」等單數形式包括複數個提及物。
    本文中所使用之「對象」意指一個脊椎哺乳動物，包括但不限於人、小鼠、大鼠、狗、貓、馬、牛、豬、綿羊、山羊或非人類靈長類動物。在一些實施例中，該對象係人。術語「對象」、「病患」及「個體」可互換使用。
    本文中所使用之「基因組」或「基因體」表示一生物其遺傳指令的完整單一拷貝，如該生物DNA所編碼。一個基因組可能是多染色體的，以致於DNA可細胞性地分佈在多個個別的染色體上。例如，人類有22對染色體再加上一個與性別相關的XX或XY對。
    本文中所使用之「EGFR突變型」或「EGFR突變」意指不同於野生型EGFR蛋白的胺基酸或核酸序列，分別位於一個對偶基因(異合子(heterozygous))或兩個對偶基因(同合子(homozygous))上，且可能為體細胞系或生殖細胞系。在一實施例中，該突變係一胺基酸或核酸的取代(substitution)、缺失(deletion)或插入(insertion)。
    本文中所使用之「染色體」意指活細胞帶有遺傳訊息的基因載體，其源自染色質並包含DNA及蛋白組成物(特別是組織蛋白)。本文中使用傳統和國際公認的人類個體基因組染色體編碼系統。個別染色體的大小可以在給定之多染色體基因組中因不同種類而變化，或因在不同基因組中而變化。
    本文中所使用之「染色體區域」係一部分之染色體。任何個別染色體區域之實際物理大小或範圍可以相差很大。術語「區域」不一定指一個特定的或更多的基因，因為一個區域不需要特別考慮到個別基因的特定編碼片段(外顯子)。
    本文中所使用之核酸的「拷貝數」意指給定樣本中核酸的分離實例數量。
    本文中所使用之「拷貝數變異」意指細胞基因體中存在的基因或遺傳區域的拷貝數量的改變。一個正常二倍體細胞的各個染色體及其中所含之基因通常具有兩個拷貝。拷貝數變異可能會增加拷貝數，或是減少拷貝數。
    本文中所使用之「拷貝數圖像」意指可以代表給定樣本在多個基因座上基因體DNA拷貝數的一組數據。例如，對於三個感興趣之基因座，拷貝數圖像代表該三個基因座之DNA拷貝數。在本文中，「基因座」意指細胞基因體中的位置，通常包含細胞基因體中兩點之間的一直線基因體DNA。該直線基因體DNA係由核苷酸序列所組成。
    本文中所使用之「預後」意指治療反應及/或獲益及/或存活率。
    本發明之一個面向為提供一種預測接受上皮生長因子受體酪胺酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)治療之EGFR突變肺腺癌對象對治療的反應的方法，包含a)提供包含來自該EGFR突變對象基因體DNA的樣本；及b)分析該基因體DNA以確定樣本染色體5p、7p、8q或14q上基因的拷貝數變異(CNAs)，其中CNAs在a)樣本中相對於在包含EGFR野生型基因體DNA樣本中的改變表示EGFR突變對象對於EGFR-TKI治療的反應較差。
    本發明之另一個面向為提供一種預測接受EGFR-TKI治療之EGFR突變肺腺癌對象預後的方法，包含a)提供包含來自該EGFR突變對象基因體DNA的樣本；及b)分析該基因體DNA以確定樣本染色體5p、7p、8q或14q上基因的拷貝數變異(CNAs)，其中當a)樣本中的CNAs相對於在包含EGFR野生型基因體DNA樣本中的CNAs改變時，則判定該對象的預後較差。
    本發明之進一步面向為提供一種測定接受EGFR-TKI治療之EGFR突變肺腺癌對象對治療的反應或測定接受EGFR-TKI治療之EGFR突變肺腺癌對象預後的診斷套組，包含一或多個含有該EGFR突變對象基因體DNA之樣本染色體5p、7p、8q或14q上基因的探針。該套組可額外包括敘述何時及如何使用該套組內容的教學工具。該套組也可包括一或多個下列所述：各種標籤或標籤試劑以方便探針的偵測，用於雜合的試劑，包括緩衝液、細胞分裂中期的細胞展片(metaphase spread)、牛血清血蛋白(BSA)及其他阻斷劑，取樣裝置包括細針頭、棉籤、抽吸器等等，正雜合控制及負雜合控制等等。
    根據本發明，EGFR酪胺酸激酶抑制劑會結合至EGFR受體上的ATP結合區並防止ATP的結合。因此，抑制劑的結合會造成EGFR介導的胞內信號被抑制。EGFR酪胺酸激酶抑制劑包括可逆和不可逆抑制劑。大多數可逆抑制劑屬於喹唑啉類，包括但不限於艾瑞莎(Iressa；N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-嗎福林-4-基丙氧基)喹唑啉-4-胺)、得舒緩(Tarceva；N-(3-乙炔苯基)-6,7-雙(2-甲氧乙氧基)喹唑啉-4-胺)及拉帕替尼(Tykerb，GW572016；N-[3-氯-4-[(3-氟苯基)甲氧基]苯基]-6-[5-[(2-甲磺醯乙胺基)甲基]-2-呋喃基]喹唑啉-4-胺)。不可逆抑制劑永久地修改了EGFR的酪胺酸激酶功能區域，藉此抑制EGFR信號。不可逆抑制劑包括但不限於CI-1033、EKB-569及HKI-272(例如，見Zhang et al.,2007,JCI 117：2051-2058)。EGFR-TKI與EGFR的結合會誘發表現EGFR的細胞凋亡，從而提供了一種用於治療癌症的方法。應領會到術語EGFR酪胺酸激酶抑制劑及EGFR激酶抑制劑在本文中可互換使用。
    根據本發明之一實施例，肺腺癌係NSCLC。
    根據本發明，在含有EGFR突變型對象基因體DNA之樣本的染色體5p、7p、8q或14q上，基因的拷貝數變異(CNAs)改變。較佳地，該CNAs在染色體7p上改變。更佳地，該CNAs在染色體7p11.2、7p14.1、7p15.2、7p15.3、8q11.21或8q11.23上改變。更佳地，該CNAs在一或多個下列代表基因上改變：位於染色體7p11.2上的EGFR、LANCL2、VSTM2A、VOPP1、SEC61G、SEPT14及HPVC1，位於染色體7p14.1上的GLI3及C7orf10，位於染色體7p15.2上的NFE2L3、MIR148A及OSBPL3，位於染色體7p15.3上的NPY，位於染色體7p22.2上的SDK1，位於染色體8p11.21上的ANK1及位於染色體8p11.23上的ADAM3A。最佳地，該CNAs在一或多個下列六個代表基因上改變：分別位於染色體7p14.1、7p15.2、7p22.2、7p11.2、7p11.2及7p11.2上的GLI3、NFE2L3、SDK1、EGFR、VOPP1及LANCL2。
    在本發明之一實施例中，CNAs的改變在染色體5p、7p或14q上為DNA增加，在染色體8q上為DNA減少。
    除非另有說明，本發明之實施可利用傳統技術以及有機化學、高分子技術、分子生物學(包括重組技術)、細胞生物學、生物化學及免疫學在該領域技藝中之敘述。該傳統技術包括高分子陣列合成、雜合(hybridization)、接合(ligation)及利用標記偵測雜合。合適技術的具體說明可以參考本文下面的例子。不過，當然也可以使用其他相等的傳統程序。該傳統技術及敘述可以在標準的實驗室手冊上找到，如Genome Analysis：A Laboratory Manual Series(Vols.I-IV)、Using Antibodies：A Laboratory Manual、Cells：A Laboratory Manual、PCR Primer：A Laboratory Manual以及Molecular Cloning：A Laboratory Manual(全部來自冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press))、Stryer,L.(1995)Biochemistry(4th Ed.)Freeman,New York、Gait,"Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach" 1984,IRL Press,London、Nelson and Cox(2000),Lehninger,Principles of Biochemistry 3rd Ed.,W.H.Freeman Pub.,New York,N.Y.以及Berg et al.(2002)Biochemistry,5th Ed.,W.H.Freeman Pub.,New York,N.Y.，上述所有文獻全體皆併入本案作為所有目的之參考。用於偵測目標區域序列、量化拷貝數、定序等等的核酸雜合陣列可在以陣列為基礎的格式上進行(如使用核酸陣列的比較基因組雜交法(comparative genomic hybridization(Cgh)))。陣列係不同「探針」或「目標」核酸(或其他化合物)與一樣本核酸雜合的多樣性。在一陣列格式中，大量不同的雜交反應可以並行運行。這提供了大量位點的快速(基本上是同時的)評估。
    核酸探針被固定在一個陣列中的固體表面上。這些探針包含本發明目標區域的部分，視情況與來自其他基因體部份的探針結合。探針可獲自任何方便的來源，包括MACs、YACs、BACs、PACs、黏質體、質體、基因體克隆的inter-Alu PCR產物、基因體克隆的限制切割、CDNA克隆、放大產物等等。該陣列可與一單一群的樣本核酸雜合，或可與兩種不同標記的集合(例如一試驗樣本及一參考樣本)一起使用。
    各種固體表面上固定核酸的許多方法為該領域中所習知。多種有機和無機聚合物，以及其他天然和合成的材料，可採用作為固體表面原料。
    示例性的固體表面包括如硝化纖維、尼龍、玻璃、石英、重氮化膜(紙或尼龍)、聚矽氧、聚甲醛、纖維素以及醋酸纖維素。此外，也可使用如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯等等的塑膠。其他可能採用的原料包括紙、陶瓷、金屬、類金屬、半導體材料、金屬陶瓷等等。此外，也可使用會形成凝膠的物質。這些原料包括蛋白質、脂多醣、矽酸鹽、瓊脂糖和聚丙烯醯胺。當固體表面為多孔的，可以根據系統性質來採用不同孔徑。
    多個不同的材料(尤其是層板)可能被採用來製備表面以獲得各種特性。例如，可以採用如酪蛋白或BSA的蛋白質，或是巨分子混合物來避免非特異性結合、簡化共價接合、增強信號檢測等等。如果探針是要共價結合，則該表面通常為多官能的或能夠被多官能化。可能存在表面上用來連結的官能基可包括羧酸、醛、胺基、氰基、乙烯基、羥基、巰基等等。例如，已經知道引入各種官能基到分子來固定核酸的方法。根據一些已知的技術和市售試劑，可以讓目標核酸共價連接到玻璃或合成熔矽石。例如，用來製備帶有一些官能基的矽烷化玻璃的材料可在市面購得或者可使用標準技術製備而得。石英蓋玻片(其自發螢光至少低於玻璃10倍)也可以被矽烷化。
    或者，探針也可固定在市售的塗珠(coated beads)或其他表面上。例如，在端點標記有生物素的核酸可與市售的抗生物素蛋白塗珠結合。卵白素(streptavidin)或抗長葉毛地黃配質抗體(anti-digoxigenin antibody)也可藉由蛋白質介導的耦合連接至矽烷化玻片。將連接至球珠的核酸懸浮於雜合混合物中可完成與核酸之雜合，清洗後接著將其沈積於一基質上以用於分析，或以流式細胞儀分析。
    比較基因組雜交法(CGH)可以在單一實驗中偵測全基因組上DNA序列的拷貝數變異並繪製成圖。在CGH的一個變異中，所提供的基因組為透過使用中期染色體所得之細胞遺傳學圖。或者，雜交探針為包含本發明目標區域序列的基因組序列陣列，視情況也包括其他基因組探針。也可以藉由在以中期染色體為基礎的CGH及以陣列為基礎的CGH中雜交螢光標記的測試核酸與參考核酸來測量相對拷貝數。
    在以中期染色體為基礎的CGH中，全部的基因體DNA係從一個體之樣本中分離，以不同的螢光染料標記，並雜交至正常的中期染色體。Cot-1 DNA是用來抑制重複序列雜交。在染色體上某個位置的兩個螢光染料所生成的螢光強度比大約與測試基因組和參考基因組中相應的DNA序列的拷貝數比例成正比。因此，根據中期染色體的細胞遺傳學圖，CGH提供了全基因組拷貝數分析。然而，使用中期染色體CGH使解析度被限制到10-20百萬鹼基(Mb)，使間隔很近的像差解析困難，且讓CGH結果連接到基因組訊息和資源只具有細胞遺傳學的準確性。
    偵測一個雜交複合物可能需要將一個信號產生複合物結合至一雙目標和探針的多核苷酸或核酸。通常情況下，這種結合係透過配體與抗配體之間(如一配體共軛探針與一信號共軛抗配體之間)的交互作用產生，例如抗體抗原或互補核酸的結合。標記物也可讓雜交複合物被間接偵測。例如，當標記物為半抗原或抗原時，可以用抗體偵測樣品。在這些系統中，連接螢光或放射性標記或酵素分子到抗體上會產生信號。藉由使用會增幅目標核酸或所偵測信號的目標核酸或信號放大系統，可以提高雜交分析的靈敏度。或者，可使用非特異性PCR引子來放大序列，而之後偵測到一特定序列的放大目標區域表示為突變。
    其他各種技術也可用於測定拷貝數。在一些實施例中，方法包含使用即時PCR放大具有未知拷貝數的試驗位點及具有已知拷貝數的參考位點。使用螢光探針和即時螢光偵測系統監測在PCR反應中的進展。對於每一個反應，當達到一界定的螢光放射閾值便測量循環數。利用標準曲線，測定每個位點試驗DNA相對於一般標準DNA的拷貝數。從相對拷貝數的比率來測定試驗位點的基因組拷貝數(見Wilke et al.(2000)Hum Mutat 16：431-436)。
    本發明提供的結果闡明了為何EGFR突變病患對EGFR TKI靶向療法的反應不一致。對於EGFR突變病患，這可能會導向更佳的病患管理。本發明提供的數據顯示對肺腺癌而言，染色體5p、7p、8q或14q為主要的染色體臂，在顯著部位有大量DNA拷貝數改變，因此它可以有效預測EGFR突變病患的整體存活率和無疾病進展存活率。在這方面，染色體7p為較佳的實施例。此外，本發明顯示六個來自染色體7p的qPCR驗證基因會產生一個以拷貝數為基礎的風險分數，其為一個與癌症分期無關的有效預測子，可預測EGFR突變病患的整體存活率和無疾病進展存活率。然而對於EGFR野生型病患，本發明也顯示同樣的特徵與整體存活率和無疾病進展存活率並無關聯。這種鮮明的對比強烈支持了使用EGFR突變狀態來定義腺癌亞型的想法。
    對治療肺癌病患的臨床醫生來說，病患的種族和藥物基因組學背景的差異在個人化治療中是可能會嚴重影響決策的重要因素。本發明辨識到集群在染色體5p、7p、8q或14q區域的基因改變可能起到至關重要的作用，而且來自這些基因改變的風險分數可能決定該病患是否將對EGFR-TKI療法有良好反應。對於為何EGFR突變病患對EGFR-TKI靶向療法仍可能有不一致的反應，本發明提供了線索。該發現也可能使臨床醫生較能預測到對治療的反應。本發明也暗示在EGFR驅動基因突變的病患中，染色體5p、7p、8q或14q區域(尤其是染色體7p)較易受到致癌物質損壞。
    雖然本發明已參照特定實施例來描述，熟習該領域之技藝人士將瞭解可以進行不同的改變，且在不脫離本發明範圍的情況下，其中元件可能被等同物替換以適應特定情況。下列實施例係用來作為論證與進一步說明本發明某些實施例的不同面向，且將不被視為是限制本發明的範圍。在下面揭露的實驗中，使用下列材料及方法： 病患及方法：
    用於微陣列CGH分析的138個癌症組織係取自國立台灣大學醫學院附設醫院與臺中榮民總醫院。用於以基因組即時qPCR預測臨床結果的114個癌症組織係取自臺中榮民總醫院。這兩組病患之間沒有重疊。外科手術後，立刻將來自肺腺癌病患的解剖組織儲存在液態氮中並匿名。依據標準程序，從每個樣本的癌症組織萃取基因組DNA並通過瓊脂醣凝膠電泳確認品質。
    用於研究治療反應的腫瘤DNA係取自臺中榮民總醫院25位以EGFR-TKI治療的EGFR突變型(外顯子19缺失和L858R)病患。一位鱗狀細胞癌病患和一位資訊不足的病人被刪除。由醫生依據RECIST 1.0的指引來評估剩下23位病患的三種反應類型：1.部份有效(Partial Response,PR)、2.疾病進展(Progressive Disease,PD)、3.無變化(Stable disease,SD)(P.Therasse SGA,E.A.Eisenhauer：New Guidelines to Evaluate the Response to Treatment in Solid Tumors(RECIST Guidelines).Journal of the National Cancer Institute 92：205-216,2000)。 微陣列比較基因組雜交法(aCGH)
    使用含有385,806個探針且探針間距約6,000 bp的全基因組NimbleGen aCGH陣列(NimbleGen®；NimbleGen Systems Inc,Madison,WI)來進行比較基因組雜交法，將來自癌症組織的DNA與萃取自一社群中一男一女的週邊血液單核細胞(PBMC)的正常DNA雜交。利用數位式超音波破碎儀(Branson Model#450,Branson,Danbury,CT)使DNA斷裂。依據使用手冊進行標記、雜交及清洗。由GenePixTM Reader(Personal 4000B,Axon Instruments,Molecular Devices,Sunnyvale,CA)與GenePix® Pro 6.0軟體進行陣列掃描並產生影像。藉由NimbleScanTM版本2.4，SignalMapTM版本1.9軟體產生常態化的log強度比數據，接著如補充資訊文1(Supplementary Information,Text 1)所述進行交錯晶片常態化。原始的CNA點對格式的數據組可在http：//kiefer.stat2.sinica.edu.tw/cghdata/取得。 基因組即時定量PCR(q-PCR)
    qPCR已被建立為一種快速且靈敏的技術，用於準確定量組織中的DNA。利用ABI prism 7900序列偵測系統(Applied Biosystem,Foster City,CA)來即時偵測報導染料所發出的螢光。以微陣列CGH探針位置的500核苷酸鄰接序列(250上游核苷酸和250下游核苷酸)為基礎來設計qPCR的引子和探針。引子和探針的序列如表1所示。
    統計分析
    首先將aCGH數據進行預處理，平均10個位置連續的探針以形成36,549個不相交的區塊。進行兩步驟的統計程序以測定出現放大或缺失頻率高的位點。首先使用t檢定來分開測定每個樣本每個探針區塊DNA增加(gain)或減少(loss)的狀態，如果一個區塊在138個樣本裡至少30%顯示為增加(或減少)，則表示為增加區塊(或減少區塊)。使用雙尾t檢定(5%顯著性)來測定區塊的增加或減少狀態。統計計算顯示在30%閾值的增加/減少區塊不太可能有低於25%(p值=0.0047)的真實盛行率。對於與EGFR突變狀態有關的比較CNA分析，使用t檢定(雙尾，5%顯著性)來比較兩組平均值。應用單變數和多變數Cox回歸模型來預測病患存活率。使用軟體MetaCoreTM進行功能富集分析(functional enrichment analysis)。染色體7p上的代表性CNA圖像係得自加權奇異值分解法。 實例1 CNA圖像結果
    以NimbleGen系統的微陣列CGH處理138個肺腺癌腫瘤上的CNA圖像。所生成的CNA圖像顯示於圖1A。統計分析偵測出全部有3,187個DNA增加的探針區塊與6,029個DNA減少的探針區塊，錯誤發現率(false discovery rate)分別為0.054及0.028。 實例2 染色體7p在基因群集區(Gene-harboring Regions)有最高的DNA增加比率
    首先檢驗有DNA增加的染色體位點。結果發現相對於臂的大小，染色體5p、7p和8q有最大的DNA增加區(表2)。就基因群集區(gene-harboring region)而言，染色體7p的增加比率是最高的。值得注意的是，EGFR與其他著名的基因如HDAC9、DGKB、MEOX2和POU6F2一起在列表中，當根據138個樣本中平均CNA值排序探針區塊時，所有這些基因都在全基因組的前1%(表3)。
    表2 全染色體中DNA增加/減少的百分比
    表3 138個肺腺癌中有最高DNA增加的前1%探針區塊
    有趣的是，在ERBB家族的四個成員中，當EGFR和ERBB4(2q34)有DNA增加時，ERBB2(17q12)和ERBB3(12q13.2)卻有DNA減少。這種增加減少的差異也可以在其他幾個家族觀察到，如間質同源箱基因(mesenchyme homeobox genes)、MEOX2(7p21.1，增加)和MEOX1(17p21，減少)；VAV家族、VAV1(19p13.2，減少)、VAV2(9q34.2，減少)和VAV3(1p13.3，增加)(表4)。為了確認高密度微陣列CGH的結果，進行基因組即時qPCR並驗證一些基因的DNA增加/減少圖樣(來自DNA增加列表的EGFR、ERBB4、MEOX2、TWIST1、TWISTNB、DGKB、VAV3、CDH12與來自DNA減少列表的ERBB2、ERBB3、MEOX1、CDH1、VAV1、VAV2、ACTN4、FAM102A)。
    表4 所選基因家族的DNA增加/減少總結 實例3 EGFR突變組中染色體7p包含最高比例的最顯著放大
    進行EGFR突變試驗檢驗是否有外顯子-21 L858R點突變或是外顯子-19框內缺失(in-frame deletion)。結果發現有這兩種類型EGFR突變的總共有81個病人，而有57個病人為野生型。研究在EGFR突變型病人中具有最顯著放大或缺失的位點，具有最大和最小CNA平均值的前1%探針區塊分別被定位為具有最高DNA增加或減少的區域。有趣的是，具有最高CNA的364個探針區塊中有81個(22.3%)落在染色體7p上，數量超過所有其他的染色體臂，而臂尺寸卻是最小的(在陣列中僅擁有2.25%的探針區塊)。即使將兩種EGFR突變型分開研究，圖像仍然相同。在另一方面，EGFR野生型組的圖像則完全不同而且染色體7p變成無足輕重。 實例4 EGFR突變組與EGFR野生型組之間染色體7p含有最多的差異CNA位點
    找出突變組與野生型組間在t檢定下有顯著差異的位點(圖1)。發現在所有染色體中，最大的CNA差異位在染色體7p上。實際上，位於該染色體臂的探針有47.13%具有CNA差異，遠超過染色體14q的比率(20.20%，位居第二)。在有較高比率缺失區塊(loss-blocks)的染色體臂(17p、19p和19q)上，只有非常少的探針位點有顯著差異，表示在突變組與野生型組之間DNA減少的圖像較一致。
    差異的大小(突變組平均值減去野生型組平均值的絕對值)也被檢驗。發現最大的差異發生在7p11.2的一個片段(長度為869K bps)，其上含有EGFR、LANCL2、VOPP1等等。該區域的CNA值在突變組中較高(表5)。LANCL2與EGFR及VOPP1與EGFR的共放大(Co-amplification)先前僅在一些腫瘤中被報導(Lu Z,et al：Glioblastoma proto-oncogene SEC61gamma is required for tumor cell survival and response to endoplasmic reticulum stress.Cancer Res 69：9105-11,2009)。
    表5 全基因組具有最大效果大小(effect size)*的前20位點
    進一步比較L858R突變型與野生型之間的差異。發現染色體7p仍然是含有最多CNA值差異位點的染色體臂(表4)。

    缺失組也與野生型比較。染色體7p排序僅次於染色體14q。最後，我們比較缺失組和L858R突變組之間的差異。顯著的探針區塊總數較少，表示這兩個突變類型有更多的相似性。 實例5 染色體7p上的不同CNA圖像
    分別取得EGFR突變組和野生型組之染色體7p上代表性的CNA圖像(圖2)。圖中可觀察到顯著的差異。EGFR突變組的圖像顯示在染色體7p上大多數的位置一致為增加，除了一開始的7p22.1部份。在另一方面，野生型組的圖像顯示有較多的位置為減少，且CNA值在染色體7p上變化很大。 實例6 用染色體7p上的集群基因組改變預測EGFR突變肺腺癌的臨床結果
    集合一個有114位腺癌病患的獨立小組以檢驗染色體7p上所檢測出的基因畸變的臨床意義。在基因分類EGFR突變狀態後，發現有51個EGFR突變病患和63個野生型病患。以Kaplan-Meier法分析整體存活率與無疾病進展存活率，顯示有強烈的階段影響(stage effect)，但是沒有突變狀態影響(status effect)(圖3)。
    針對一組來自染色體7p的六個代表性基因GLI3、NFE2L3、SDK1、EGFR、VOPP1及LANCL2設計探針並進行基因組即時qPCR以測量這些基因在114個腫瘤中的CNAs。如先前所討論，VOPP1和LANCL2位於EGFR旁。其他的三個基因大約以相同的間隔覆蓋染色體7p的其他部份。在我們138位病患的微陣列CGH數據中，所有六個基因均懷有在EGFR突變型與野生型之間有差異CNA值的位點。用t檢定確認突變組與野生型組之間的差異(表5)。
    表5 EGFR突變組與野生型組之間的拷貝數差異*
    利用該六個基因的平均拷貝數來預測EGFR突變組病患的存活率(圖4A)。如圖4B所示，對數等級檢定(log rank test)和單變量Cox回歸都顯示這個以拷貝數為基礎的風險分數(CNA-risk score)能以整體存活率與無疾病進展存活率區分出高風險病患與低風險病患。進行多變量Cox回歸，結果顯示本發明的CNA風險分數的預測能力與癌症階段無關(表6)。
    表6 整體存活率與無疾病進展存活率分析的多變量Cox回歸結果
    同樣六個基因的拷貝數平均也被使用來預測EGFR野生型組病患的存活率。與EGFR突變組的結果形成鮮明對比，對數等級檢定和Cox回歸都對整體存活率與無疾病進展存活率無任何預測能力(圖4C)。
    藉由單變量Cox回歸檢驗該六個基因中各個基因對存活率的預測能力(表7)。
    表7 EGFR突變病患與EGFR野生型病患中的六個基因對存活率的預測能力
    如同預期，結果顯示在EGFR突變組與EGFR野生型組之間有顯著的差異。在突變組中，該六基因的p值對整體存活率與無疾病進展存活率的預測不是顯著(p<0.05)就是接近顯著(最大p值為0.118)。在野生型組中，p值就大的多了。
    為了檢驗該六基因預測病人藥物反應的能力，23個具有EGFR敏感突變(L858R或外顯子-19缺失)的晚期肺腺癌病患被分為兩組：由11位部份有效(Partial Response,PR)病患所組成之反應良好組與由12位無變化(Stable disease,SD)或疾病進展(Progressive Disease,PD)病患所組成之反應較差組。如圖4A所示，六個基因的平均CNA在反應良好組病患中顯著較小(t檢定，p=0.004)。
    此外，如圖4B所示，可發現在該集群中同時存在四個或更多CNA高於平均的基因與藥物反應較差有關(n=23，費雪精確性檢定(Fisher exact test)，p=0.0069)。
    圖1顯示EGFR突變狀態比較中所發現的差異CNA位點。在三種比較中(EGFR突變組比上野生型組，L858R突變組比上EGFR野生型組，以及外顯子-19框內缺失組比上EGFR野生型組)展現出差異CNA的探針區塊位點顯示於每個染色體示意圖的右邊。最右邊是一個放大版本的染色體7p以及一些值得注意的基因的位置。
    圖2顯示肺腺癌的EGFR突變組及EGFR野生型組在染色體7p上代表性的CNA圖像。
    圖3顯示整體存活率與無疾病進展存活率分析的Kaplan-Meier曲線。考慮的臨床變數為EGFR突變狀態、年齡、性別和抽煙狀態。
    圖4顯示以染色體7p上六個基因的DNA拷貝數預測存活率。(A)病患由左到右以CNA風險分數低到高依序列出。每位病患的存活時間繪製於最上方。最下方則以熱圖(heat map)顯示六個基因的拷貝數。淡藍色虛線代表CNA風險分數的中位數，將病患分為低風險組與高風險組。(B)EGFR突變病患之整體存活率與無疾病進展存活率分析的Kaplan-Meier曲線。根據CNA風險分數平均分配為高風險組與低風險組。(C)與(B)為同樣的分析，只是對象換為EGFR野生型組病患。
    圖5顯示(A)CNA風險分數分佈的箱形圖(box plot)。反應良好者(部份有效，有11例)與反應較差者(疾病進展或無變化，有12例)有顯著差異。圖上也給出雙尾t檢定(two-sided t-test)的p值。(B)EGFR-TKI治療反應與染色體7p上多個基因的拷貝數增加有關。圖上也給出費雪精確性檢定(Fisher exact test)的p值。
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    权利要求:
    Claims (27)
    [1] 一種預測接受上皮生長因子受體酪胺酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)治療之EGFR突變肺腺癌個體對治療的反應的方法，包含a)提供包含來自該EGFR突變個體基因體DNA的樣本；及b)分析該基因體DNA以確定樣本染色體5p、7p、8q或14q上基因的拷貝數變異(CNAs)，其中CNAs在a)樣本中相對於在包含EGFR野生型基因體DNA樣本中的改變表示EGFR突變個體對於EGFR-TKI治療的反應較差。
    [2] 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該肺腺癌係非小細胞肺癌(NSCLC)。
    [3] 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該EGFR-TKI係艾瑞莎(Iressa；N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-嗎福林-4-基丙氧基)喹唑啉-4-胺)、得舒緩(Tarceva；N-(3-乙炔苯基)-6,7-雙(2-甲氧乙氧基)喹唑啉-4-胺)及拉帕替尼(Tykerb，GW572016或N-[3-氯-4-[(3-氟苯基)甲氧基]苯基]-6-[5-[(2-甲磺醯乙胺基)甲基]-2-呋喃基]喹唑啉-4-胺)。
    [4] 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該EGFR-TKI係CI-1033、EKB-569或HKI-272。
    [5] 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中步驟b)中該樣本染色體7p上基因的拷貝數變異(CNAs)被測定。
    [6] 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中步驟b)中的基因係位於染色體7p11.2、7p14.1、7p15.2、7p15.3、8q11.21或8q11.23。
    [7] 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中步驟b)中的基因係選自由以下所組成之群組：位於染色體7p11.2上的EGFR、LANCL2、VSTM2A、VOPP1、SEC61G、SEPT14及HPVC1，位於染色體7p14.1上的GLI3及C7orf10，位於染色體7p15.2上的NFE2L3、MIR148A及OSBPL3，位於染色體7p15.3上的NPY，位於染色體7p22.2上的SDK1，位於染色體8p11.21上的ANK1及位於染色體8p11.23上的ADAM3A。
    [8] 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中步驟b)中的基因係GLI3、NFE2L3、SDK1、EGFR、VOPP1或LANCL2或彼等之組合。
    [9] 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中CNAs的改變在染色體5p、7p或14q上為DNA增加，在染色體8q上為DNA減少。
    [10] 一種預測接受EGFR-TKI治療之EGFR突變肺腺癌個體預後的方法，包含a)提供包含來自該EGFR突變個體基因體DNA的樣本；及b)分析該基因體DNA以確定樣本染色體5p、7p、8q或14q上基因的拷貝數變異(CNAs)，其中當a)樣本中的CNAs相對於在包含EGFR野生型基因體DNA樣本中的CNAs改變時，則判定該個體的預後較差。
    [11] 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中該肺腺癌係非小細胞肺癌(NSCLC)。
    [12] 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中該EGFR-TKI係艾瑞莎(Iressa；N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-嗎福林-4-基丙氧基)喹唑啉-4-胺)、得舒緩(Tarceva；N-(3-乙炔苯基)-6,7-雙(2-甲氧乙氧基)喹唑啉-4-胺)及拉帕替尼(Tykerb，GW572016或N-[3-氯-4-[(3-氟苯基)甲氧基]苯基]-6-[5-[(2-甲磺醯乙胺基)甲基]-2-呋喃基]喹唑啉-4-胺)。
    [13] 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中該EGFR-TKI係CI-1033、EKB-569或HKI-272。
    [14] 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中步驟b)中該樣本染色體7p上基因的拷貝數變異(CNAs)被測定。
    [15] 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中步驟b)中的基因係位於染色體7p11.2、7p14.1、7p15.2、7p15.3、8q11.21或8q11.23。
    [16] 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中步驟b)中的基因係選自由以下所組成之群組：位於染色體7p11.2上的EGFR、LANCL2、VSTM2A、VOPP1、SEC61G、SEPT14及HPVC1，位於染色體7p14.1上的GLI3及C7orf10，位於染色體7p15.2上的NFE2L3、MIR148A及OSBPL3，位於染色體7p15.3上的NPY，位於染色體7p22.2上的SDK1，位於染色體8p11.21上的ANK1及位於染色體8p11.23上的ADAM3A。
    [17] 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中步驟b)中的基因係GLI3、NFE2L3、SDK1、EGFR、VOPP1或LANCL2或彼等之組合。
    [18] 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中CNAs的改變在染色體5p、7p或14q上為DNA增加，在染色體8q上為DNA減少。
    [19] 一種測定接受EGFR-TKI治療之EGFR突變肺腺癌個體對治療的反應或測定接受EGFR-TKI治療之EGFR突變肺腺癌個體預後的診斷套組，包含一或多個含有該EGFR突變個體基因體DNA之樣本染色體5p、7p、8q或14q上基因的探針。
    [20] 如申請專利範圍第19項所述之診斷套組，其中該肺腺癌係非小細胞肺癌(NSCLC)。
    [21] 如申請專利範圍第19項所述之診斷套組，其中該EGFR-TKI係艾瑞莎(Iressa；N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-嗎福林-4-基丙氧基)喹唑啉-4-胺)、得舒緩(Tarceva；N-(3-乙炔苯基)-6,7-雙(2-甲氧乙氧基)喹唑啉-4-胺)及拉帕替尼(Tykerb，GW572016或N-[3-氯-4-[(3-氟苯基)甲氧基]苯基]-6-[5-[(2-甲磺醯乙胺基)甲基]-2-呋喃基]喹唑啉-4-胺)。
    [22] 如申請專利範圍第19項所述之診斷套組，其中該EGFR-TKI係CI-1033、EKB-569或HKI-272。
    [23] 如申請專利範圍第19項所述之診斷套組，其中該基因位於染色體7p上。
    [24] 如申請專利範圍第19項所述之診斷套組，其中該基因係位於染色體7p11.2、7p14.1、7p15.2、7p15.3、8q11.21或8q11.23。
    [25] 如申請專利範圍第19項所述之診斷套組，其中步驟b)中的基因係選自由以下所組成之群組：位於染色體7p11.2上的EGFR、LANCL2、VSTM2A、VOPP1、SEC61G、SEPT14及HPVC1，位於染色體7p14.1上的GLI3及C7orf10，位於染色體7p15.2上的NFE2L3、MIR148A及OSBPL3，位於染色體7p15.3上的NPY，位於染色體7p22.2上的SDK1，位於染色體8p11.21上的ANK1及位於染色體8p11.23上的ADAM3A。
    [26] 如申請專利範圍第19項所述之診斷套組，其中染色體7p上的基因係GLI3、NFE2L3、SDK1、EGFR、VOPP1或LANCL2或彼等之組合。
    [27] 如申請專利範圍第19項所述之診斷套組，其中CNAs的改變在染色體5p、7p或14q上為DNA增加，在染色體8q上為DNA減少。
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    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    US201161504512P| true| 2011-07-05|2011-07-05||
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